In 2000 verscheen er weer een nieuwe lijn 65, als versterkinglijn van lijn 165 tussen Amstelveen, Plein 1960 en het Haarlemmermeerstation. Later werd de lijn ingekort tot station Zuid WTC en in 2006 ging de lijn op in de huidige lijn 165. Lijn 65 reed alleen doordeweeks overdag.
De huidige lijn 65 werd in december 2009 ingesteld en was de oude oostelijke tak van lijn 15, maar werd vanaf de Insulindeweg doorgetrokken Molukkenstraat verlegd naar het KNSM-eiland via de route van de tot het Muiderpoortstation ingekorte lijn 41.